Мозг собирается из двух независимых зачатков: открытие Стэнфорда опровергло модель Ньюкоопа

Человеческий мозг кажется монолитом. Кора больших полушарий анатомически перетекает в подкорковые структуры, те — в средний мозг, дальше ствол, а ствол смыкается со спинным мозгом. Именно эта внешняя слитность почти семьдесят лет заставляла ученых думать, что весь мозг развивается из одной-единственной группы эмбриональных клеток. Оказалось, это иллюзия. Мозг собирается из двух независимых зачатков, и выбор между ними клетка делает в первые двое суток жизни зародыша — задолго до того, как в мозге появляются хоть какие-то нейронные отростки.

Канон заложил нидерландский эмбриолог Питер Ньюкооп в 1952 году. По его модели, в зародыше сначала возникает универсальная нервная ткань со свойствами передних отделов мозга. Затем окружающие ткани выделяют химические вещества, концентрация которых плавно нарастает от будущей головы к хвосту. Под этим градиентом задняя часть исходной ткани постепенно перестраивается в ствол и спинной мозг. Из логики Ньюкоопа следовало: любая ранняя нервная клетка способна стать чем угодно — судьбу решает лишь то, в какой точке химического градиента она случайно оказалась.

Группа Кайла Ло из Стэнфордского университета эту модель опровергла. Проследив за развитием мышиных эмбрионов и человеческих плюрипотентных стволовых клеток, биологи увидели, что с самого начала существуют две параллельные и изолированные популяции. Первая создает исключительно передний и средний мозг, вторая отвечает только за задний — мозжечок, мост и продолговатый мозг. Разделение происходит на вторые сутки культивирования: клетки дефинитивной эктодермы расходятся на две группы с взаимоисключающими генетическими программами. Передняя популяция включает белок OTX2 и наглухо выключает GBX2, задняя делает ровно наоборот — гасит OTX2 и активирует GBX2 вместе с набором генов семейства HOX. Никаких зрелых маркеров нервных стволовых клеток вроде PAX6 или SOX1 в этот момент еще нет. Судьба отделов мозга определяется раньше, чем сами отделы начинают анатомически обособляться.

Отдельная история — как именно запускается задний мозг. Годами биологи пытались вырастить клетки ствола, активируя сигнальный каскад WNT: раз его белки физиологически сконцентрированы в задней части зародыша, казалось логичным, что именно этот путь и отвечает за ствол. Эксперименты показали обратное. Стимуляция WNT действительно разворачивала клетки назад, но уводила их мимо головного мозга — они начинали производить BRACHYURY и CDX2, маркеры спинного мозга и переходных нервно-мышечных клеток туловища. Чтобы получить именно задний мозг, нужна принципиально другая комбинация:

• путь WNT необходимо полностью блокировать, иначе клетки уйдут в предшественники спинного мозга;
• одновременно с блокировкой WNT, BMP и TGF-β к клеткам добавляют фактор роста фибробластов (FGF) и ретиноевую кислоту;
• только совместное присутствие FGF и ретиноевой кислоты активирует GBX2 и подавляет OTX2 — по отдельности ни один из факторов результата не дает.

Дальше исследователи проверили, насколько жестко зафиксирована судьба клеток. Перекрестные тесты выглядели жестоко: клетки передней нейроэктодермы помещали в среду для заднего мозга, задние — в среду, стимулирующую передний. Ни одна популяция специализацию не сменила. Задние клетки проигнорировали сигналы переднего мозга и не включили гены SIX3 и FOXG1, отвечающие за построение полушарий. Передние не активировали HOXA1, HOXA3 и MAFB. Клетки не поддались даже при смешивании обеих популяций в соотношении 1:1 в одной емкости — а ведь в биологии развития известен «эффект сообщества», когда большая группа клеток подчиняет себе соседей через собственные регуляторные белки. Здесь не сработало и это.

Причина устойчивости вскрылась при анализе пространственной организации ДНК методом OmniATAC-seq, который показывает, какие участки генома физически доступны для считывания, а какие свернуты и заблокированы. В передних клетках регуляторные зоны генов заднего мозга, в частности области HOX, спрессованы — факторы транскрипции просто не могут связаться с ДНК, тогда как участки, управляющие развитием коры, открыты. В задних клетках картина зеркальная: открыты области связывания HNF1B, MAFB и HOX, а передние программы заблокированы. Клетка не отвечает на внешний химический сигнал не из-за отсутствия сигнала, а потому что нужные фрагменты генома закрыты на уровне структуры хроматина. Это не выбор под давлением среды, а замок, защелкнутый на 48-м часу развития.

Лабораторные культуры не всегда повторяют живой организм, поэтому выводы подтвердили на эмбрионах мышей методом избирательного генетического мечения. Биологи скрестили мышей линии Gbx2-CreER с репортерной линией ROSA26-tdTomato: фермент Cre активируется только в присутствии 4-гидрокситамоксифена и только в клетках, где работает ген Gbx2, после чего клетка навсегда начинает производить красный светящийся белок — и передает это свойство всем потомкам. Препарат ввели беременным самкам на 7,5 суток эмбрионального развития, окно мечения составило около 12 часов. На стадиях 8,5, 9,5 и 18,5 суток все меченые клетки и их потомки обнаружились строго в пределах заднего мозга — в мозжечке, ядрах черепных нервов и продолговатом мозге. В переднем и среднем мозге не нашлось ни одной светящейся клетки, а граница распределения красного белка точно совпала с анатомической границей между средним и задним мозгом. Дополнительно авторы применили репортерную систему Confetti, окрашивающую отдельные клетки в один из трех цветов: из 494 клеточных кластеров в 16 эмбрионах около 63% состояли исключительно из клеток переднего и среднего мозга, 33% располагались строго в заднем, и менее 4,5% оказались на границе.

Практический смысл работы лежит в медицине. Задний мозг управляет дыханием, сердечным ритмом, давлением, сном и глотательным рефлексом. Детская диффузная глиома моста неизлечима именно из-за разрушения этих центров. При боковом амиотрофическом склерозе и спинальной мышечной атрофии гибнут двигательные нейроны заднего мозга, управляющие мышцами лица, языка, глотки и шеи через черепные нервы. Когда они дегенерируют, человек теряет способность глотать, пища и слюна попадают в дыхательные пути, развивается воспаление легких — и пациент погибает от удушья. Двигательные нейроны, иннервирующие глотку через языкоглоточный нерв, развиваются из строго определенных сегментов заднего мозга — ромбомеров 5 и 6. Получить эти конкретные клетки человека в лаборатории до сих пор не удавалось: стандартные протоколы дифференцировки уводили клетки по пути переднего мозга.

Теперь рецепт известен. За первые два дня из стволовых клеток получают заднюю нейроэктодерму с маркером GBX2. С 2 по 4 день клетки обрабатывают FGF2 и умеренными дозами стимулятора WNT — появляются предшественники ромбомеров 5 и 6 с маркерами MAFB, HNF1B и HOXA3. С 4 по 7 день популяцию разделяют на спинные сенсорные и брюшные двигательные предшественники, регулируя баланс сигналов Hedgehog и WNT. К 14 дню под действием нейротрофических факторов BDNF и GDNF и блокатора пути NOTCH формируются зрелые двигательные нейроны заднего мозга. Они экспрессируют ISL1, специфические маркеры ромбомеров 5/6 (PHOX2A, PHOX2B, HOXA1, HOXA3) и ферменты синтеза ацетилхолина CHAT и VACHT, но не содержат белков спинного мозга HOXA5 и MNX1 — точность происхождения подтверждена. Электрофизиология показала, что нейроны живые: генерируют потенциалы действия при ступенчатой подаче тока, датчик GCaMP6f зафиксировал регулярные спонтанные колебания кальция в цитоплазме, характерные для функциональных синаптических сетей. А после встройки вирусным вектором гена светочувствительного канала bReaChES импульсы света с длиной волны 560 нанометров мгновенно возбуждали клетки и вызывали серию электрических разрядов. Это готовая клеточная модель для изучения механизмов нарушения глотания при БАС и СМА и для скрининга лекарств прямо на человеческих клетках.

Эволюционный возраст этого механизма впечатляет. Анализ эмбрионов макак, цыплят и рыбок данио-рерио показал, что у всех нейроэктодерма на стадии гаструляции уже разделена на переднюю (Otx2+) и заднюю (Gbx2+ или Gbx1+) части. Затем ученые обратились к желудевому червю Saccoglossus kowalevskii — морскому донному животному из типа полухордовых, чья линия разошлась с хордовыми примерно 550–600 миллионов лет назад, в начале кембрийского периода. У червя нет ни спинного, ни головного мозга: нервная система — это сетчатое сплетение клеток под наружным слоем кожи. И все же окрашивание эмбрионов на стадии гаструлы выявило четкое разделение: передняя зона вырабатывает фактор otx, задняя — gbx, граница между ними резкая, клетки не смешиваются. Значит, механизм разделения будущей нервной ткани на два независимых пространственных домена возник у общего предка всех вторичноротых задолго до появления черепа, позвоночника и централизованного мозга.

Картина строения нервной системы меняется фундаментально. Эмбриология и раньше доказала, что спинной мозг отделен по происхождению от головного: он возникает из нейромезодермальных клеток, которые одновременно служат источником для скелетных мышц спины. Новая работа показывает, что и сам головной мозг не происходит из одного источника. Центральная нервная система собирается из трех независимых эмбриональных компонентов: передней нейроэктодермы (кора полушарий, базальные ядра, гипоталамус, средний мозг), задней нейроэктодермы (мост, мозжечок, продолговатый мозг) и нейромезодермы (спинной мозг). Принцип знаком по устройству человеческого сердца: оно тоже развивается не из одной мышечной закладки, а из двух независимых зон — первого и второго сердечных полей, которые затем сливаются в единый орган с несколькими камерами. Анатомическая непрерывность мозга взрослого человека — результат слияния клеточных систем, генетически изолированных друг от друга с первых дней зародыша. И знание точных сигнальных путей каждой зоны превращает это открытие в рабочий инструмент: теперь любые типы нервных клеток человека можно воспроизводить для фундаментальных исследований и заместительной клеточной терапии.

По материалам: iXBT