Лекарство от рака теперь делают из молока: как наночастицы доставляют генную терапию точно в опухоль

Идея лечить рак не химией, сжигающей всё живое на своём пути, а точечным редактированием генетических инструкций самой опухоли, витает в научной среде уже несколько десятилетий. Технически человечество научилось синтезировать молекулы, способные выключать конкретные гены, ответственные за бесконтрольное деление клеток. Речь идёт о малых интерферирующих РНК, коротких цепочках нуклеотидов, которые запускают в клетке механизм уничтожения определённой матричной РНК, тем самым прекращая производство белка, необходимого опухоли для роста. Однако молекулы РНК в чистом виде беспомощны в агрессивной среде организма. В крови они разрушаются ферментами за несколько минут после введения. Клеточная мембрана с её отрицательным зарядом отталкивает такие же отрицательно заряженные молекулы нуклеиновых кислот. А даже если небольшая часть терапевтического агента и проникает внутрь клеток, происходит это хаотично, затрагивая здоровые ткани, что сводит на нет главное преимущество метода — его избирательность.

Решение пришло не из лаборатории синтетической химии, а из природного источника — коровьего молока, содержащего готовые наноконтейнеры, которые эволюция оттачивала миллионы лет.

Речь об экзосомах — внеклеточных везикулах нанометрового размера, которые выделяются клетками всех живых организмов. По сути, это микроскопические контейнеры диаметром от тридцати до ста пятидесяти нанометров, ограниченные той же двойной липидной мембраной, из которой построены стенки живых клеток. Внутри такой контейнер содержит белки, липиды и различные типы РНК, а снаружи несёт на поверхности белковые маркеры, определяющие его судьбу в организме.

В живой природе экзосомы выполняют роль почтовых курьеров межклеточной связи. Они отпочковываются от одной клетки, путешествуют по внеклеточной жидкости или кровотоку, находят клетку-мишень и доставляют ей молекулярное сообщение, которое может изменить её поведение. Клетки рака, кстати, активно используют эту систему для подавления иммунитета и привлечения питательных веществ, но учёных заинтересовала возможность перехватить управление этой курьерской службой в терапевтических целях.

Особый интерес представляют экзосомы, содержащиеся в коровьем молоке. В одном литре молока находится более триллиона таких частиц. Они безвредны для человека, не вызывают иммунного ответа, способны преодолевать биологические барьеры, включая стенку кишечника и даже гематоэнцефалический барьер, защищающий мозг. Их можно выделять в промышленных количествах, используя уже существующую инфраструктуру молочной промышленности и методы тангенциальной проточной фильтрации, которые позволяют перерабатывать тысячи литров сырья. При этом экзосомы сохраняют целостность не только в агрессивной среде желудочно-кишечного тракта, но и выдерживают промышленную обработку.

Технология загрузки и навигации

Превращение природной экзосомы в терапевтическое средство требует решения двух инженерных задач: поместить внутрь нужный генетический материал и снабдить частицу системой точной навигации к опухоли.

Для загрузки молекул РНК внутрь экзосом разработано несколько протоколов. Наиболее эффективным признан метод электропорации, при котором на суспензию экзосом и терапевтических молекул воздействуют короткими электрическими импульсами. Под действием электрического поля в липидной мембране временно открываются поры, через которые молекулы РНК проникают внутрь везикулы, после чего мембрана вновь смыкается, запирая груз внутри. Альтернативный подход — обработка ультразвуком, которая создаёт в жидкости кавитационные пузырьки, лопающиеся с выделением энергии, достаточной для временного нарушения целостности мембраны экзосом.

После загрузки экзосома превращается в наноконтейнер, внутри которого терапевтическая РНК надёжно защищена от ферментов крови. Однако без дополнительной модификации такая частица будет циркулировать по организму бессистемно, распределяясь в основном в печени и селезёнке — органах, отвечающих за фильтрацию крови. Чтобы направить экзосому именно к опухолевым клеткам, её поверхность функционализируют навигационными молекулами.

Наиболее перспективный подход, разработанный исследователями Университета Небраски-Линкольн, заключается в прикреплении к мембране экзосомы трёх типов коротких пептидов. Первый пептид выполняет функцию адресной метки и обеспечивает избирательное связывание с рецепторами на поверхности раковых клеток. Второй пептид посылает сигнал «не ешь меня» макрофагам — клеткам иммунной системы, которые в противном случае поглотили бы и уничтожили чужеродную частицу. Третий пептид способствует выживанию экзосомы после того, как она проникнет внутрь клетки-мишени, помогая ей избежать разрушения в лизосомах.

Ключевое техническое новшество, позволившее реализовать эту схему, связано со способом крепления пептидов. Простое пришивание пептидов к липидной мембране через гидрофобные якоря оказалось ненадёжным: при контакте с липопротеинами крови якорь отсоединяется, и навигационная система выходит из строя. Решение было найдено в использовании трансмембранного белка CD81, который прочно встроен в мембрану экзосомы. Создав на этом белке специальные точки стыковки, исследователи обеспечили стабильное удержание навигационных пептидов на протяжении всего пути частицы от места введения до опухоли.

Экспериментальные подтверждения эффективности

В экспериментах по лечению холангиокарциномы — агрессивного рака желчных протоков с крайне неблагоприятным прогнозом, использовались молочные экзосомы, загруженные малыми интерферирующими РНК против генов, управляющих пролиферацией опухолевых клеток. На поверхность частиц были прикреплены аптамеры — короткие цепочки ДНК, избирательно связывающиеся с раковыми клетками. Аптамеры были отобраны из библиотеки, содержащей шестьсот триллионов случайных последовательностей, по принципу максимального сродства к мембране клеток холангиокарциномы и минимального к здоровым клеткам печени.

Результаты, опубликованные в журнале JHEP Reports, показали, что после системного введения такие модифицированные экзосомы избирательно накапливались в опухолевой ткани, доставляли терапевтическую РНК внутрь раковых клеток и запускали механизм РНК-интерференции, приводящий к подавлению экспрессии генов-мишеней. Следствием становилось значительное замедление роста опухоли и увеличение доли клеток, вступающих на путь апоптоза — программируемой клеточной гибели. При этом окружающая здоровая ткань печени не демонстрировала признаков повреждения.

Аналогичные результаты были получены на модели колоректального рака. В этом случае мишенью служил ген Aurora kinase A, дерегуляция которого характерна для многих солидных опухолей и ассоциирована с неблагоприятным прогнозом. Исследование, опубликованное в Molecular Therapy — Nucleic Acids, показало, что молочные экзосомы с загруженной короткой интерферирующей РНК против этого гена эффективно подавляли его активность в опухолевых клетках, что приводило к замедлению их деления и снижению выживаемости. Дополнительные эксперименты подтвердили, что экзосомы не только доставляют РНК в клетку, но и защищают её от деградации внеклеточными рибонуклеазами, благодаря чему терапевтический эффект сохраняется в течение длительного времени.

Ещё одно направление исследований продемонстрировало, что молочные экзосомы пригодны не только для доставки генетического материала, но и для транспортировки традиционных химиотерапевтических агентов. В экспериментах на клетках глиомы, загруженные противоопухолевым антибиотиком митрамицином, эффективно подавляли пролиферацию, миграцию и инвазивность раковых клеток, одновременно индуцируя апоптоз.

Производство

Ведётся работа по оптимизации производственных процессов. Уже существуют протоколы выделения экзосом из молока в масштабах, достаточных для промышленного производства лекарственных препаратов. Разрабатываются методы стандартизации конечного продукта, поскольку для клинического применения каждая партия наночастиц должна обладать воспроизводимыми характеристиками по размеру, загрузке и биологической активности.

Универсальность платформы является её ключевым преимуществом. Одна и та же производственная линия может использоваться для создания препаратов против различных типов рака. Достаточно изменить загружаемую терапевтическую молекулу и навигационный пептид на поверхности экзосомы. В перспективе технология может быть адаптирована для лечения нейродегенеративных заболеваний, при которых требуется доставка терапевтических агентов через гематоэнцефалический барьер, а также для редких генетических патологий, где необходима пожизненная заместительная терапия