Ученые научились выключать «гормон любви»: почему точечная блокировка окситоцина поможет в изучении мозга

Окситоцин и вазопрессин — это нейропептиды, которые выполняют ключевые функции в организме млекопитающих. Их эволюционная история насчитывает около 600 миллионов лет, и за это время они стали важнейшими регуляторами как физиологических процессов, так и сложного социального поведения. Вазопрессин отвечает за поддержание водного баланса, регуляцию артериального давления, а в головном мозге контролирует реакции бдительности, уровень стресса и агрессию. Окситоцин действует иначе: он стимулирует сокращения матки при родах, а на уровне нервной системы подавляет страх, снижает тревожность, способствует формированию социальных связей, доверия и привязанности.

Нарушение баланса в работе этих двух нейропептидов является фактором развития множества тяжелых состояний, включая расстройства аутистического спектра, клиническую депрессию и посттравматическое стрессовое расстройство. Только вот изучение их точного воздействия на мозг сталкивается с серьезными методологическими препятствиями, которые до недавнего времени считались непреодолимыми.

Проблема диффузии и неконтролируемой активности

Классические нейромедиаторы передают сигнал строго от одной клетки к другой через узкое пространство синапса. Нейропептиды работают по иному принципу. После высвобождения клеткой они долгое время не разрушаются и распространяются по межклеточному пространству в разные области мозга.

Если исследователи хотят изучить, как окситоцин влияет на определенный участок коры головного мозга, стандартные методы оказываются неэффективными. При введении раствора окситоцина в ткань препарата или при инъекции животному вещество мгновенно растекается. Оно активирует рецепторы не только в целевой зоне, но и в соседних отделах мозга. Из-за этого невозможно установить, какая именно группа нейронов отвечает за наблюдаемую физиологическую или поведенческую реакцию. Ученым был необходим инструмент, который позволил бы доставлять пептид в ткани в неактивном виде и включать его работу только в заданное время и в заданном месте.

Решение этой задачи предложила международная группа исследователей из Венского университета и Университета Квинсленда. В своей работе они применили методы фотофармакологии, чтобы создать химические производные окситоцина и вазопрессина, активность которых контролируется исключительно светом.

Механика химической защиты

Суть фотофармакологии заключается в присоединении к молекуле активного вещества специальной химической группы, которая называется фотоклеткой. Эта группа физически препятствует связыванию молекулы с клеточным рецептором. До тех пор, пока фотоклетка находится на месте, вещество остается полностью инертным. Оно может свободно циркулировать в тканях или накапливаться в них без какого-либо физиологического эффекта. Но как только на это соединение воздействует свет определенной длины волны, химическая связь разрывается. Фотоклетка отделяется, и в ткани высвобождается активный пептид.

Создание такой структуры требует высокой химической точности. Ранние варианты защитных групп имели недостатки. Для их разрушения требовалось жесткое ультрафиолетовое излучение. Ультрафиолет обладает низкой проникающей способностью в биологических тканях, а также вызывает окислительный стресс, повреждает ДНК и приводит к гибели клеток. Кроме того, старые типы фотоклеток при распаде образовывали токсичные соединения, которые напрямую отравляли изучаемые нейроны.

Чтобы избежать этих проблем, исследователи разработали и протестировали три новых класса защитных химических групп, реагирующих на более длинноволновое излучение (от безопасного ближнего ультрафиолета до зеленого спектра видимого света):

1. DCMAC (производное кумарина) — реагирует на излучение с длиной волны 365-405 нанометров.
2. DCANBP (нитробифенилпропил) — реагирует на 405 нанометров.
3. BODIPY — реагирует на зеленый свет с длиной волны 527 нанометров.

Защитные группы были присоединены к N-концевой аминогруппе пептидов. Этот участок был выбран по двум причинам: во-первых, он критически важен для связывания с рецептором, а во-вторых, его блокировка защищает молекулу от преждевременного разрушения ферментами в биологической среде.

Результаты химического отбора

В ходе тестов группа BODIPY показала неудовлетворительные результаты. Данное химическое соединение оказалось слишком склонным к растворению в жирах (липофильным). Из-за этого модифицированный пептид сохранял способность частично активировать рецепторы даже без воздействия света. Более того, в водной физиологической среде связь с фотоклеткой BODIPY разрушалась самопроизвольно.

Группы DCMAC и DCANBP показали высокую эффективность. Присоединение этих молекул снизило базовую активность окситоцина в несколько тысяч раз, сделав его полностью неактивным для клеток. При облучении светодиодами в течение всего 15-60 секунд химическая связь быстро распадалась, высвобождая полноценный гормон без образования цитотоксичных отходов.

Проверка безопасности и работоспособности на клетках

Чтобы подтвердить работоспособность технологии, ученые провели серию экспериментов на культуре клеток человека (HEK-293), в которые были искусственно внедрены рецепторы окситоцина. В питательную среду добавляли модифицированные пептиды и выдерживали их в темноте. Приборы не фиксировали никаких изменений — клетки игнорировали присутствие вещества.

Затем исследователи включали светодиоды. Под действием света защитные группы отсоединялись, рецепторы клеток распознавали свободный окситоцин и активировались. Это подтверждалось процессом интернализации — рецепторы перемещались с поверхности мембраны внутрь клетки, что является стандартным биологическим ответом на присутствие гормона. Дополнительный тест на токсичность показал, что облученные клетки остаются полностью жизнеспособными в течение 48 часов, что подтвердило безопасность использованных химических соединений.

Абсолютный контроль: двухфотонное возбуждение

Несмотря на успех со светодиодами, обычный свет освещает слишком большую площадь. Для исследований на уровне отдельных клеток этот метод недостаточно точен. Чтобы добиться максимального пространственного контроля, ученые использовали метод двухфотонного возбуждения в сочетании с соединениями группы DCMAC.

Вместо источника видимого света применяется инфракрасный лазер. Энергия одного инфракрасного фотона слишком мала, чтобы разорвать связь между окситоцином и защитной группой. Расщепление происходит исключительно в том случае, если молекула поглощает два фотона практически одновременно. Вероятность такого события существует только в одной строго определенной микроскопической точке — в самом фокусе лазерного луча. При этом инфракрасное излучение проникает глубоко в нервную ткань, не повреждая ее.

Этот метод был протестирован на живых срезах коры головного мозга мышей. Нейроны ткани были предварительно генетически модифицированы: в них внедрили кальциевые сенсоры GCaMP, которые начинают излучать свечение при активации окситоциновых рецепторов.

Исследователи погрузили мозговую ткань в раствор с неактивным окситоцином DCMAC. В темноте сенсоры не фиксировали активности. Затем ученые направили лазер на конкретный участок ткани. В течение миллисекунд после облучения 67% нейронов в зоне фокуса лазера начали излучать свечение, сигнализируя о поглощении окситоцина. Введение в раствор препаратов, блокирующих рецепторы, полностью останавливало эту реакцию. Это окончательно подтвердило, что клетки реагируют на локально высвобожденный окситоцин, а не на температурное или световое воздействие лазера.

Научное значение разработки

Ранее исследователи не могли контролировать концентрацию вещества после его введения в мозг. Теперь они получили возможность насыщать нейронные ткани биологически инертными молекулами в любых объемах, а затем активировать их с микрометровой точностью и в точно заданное время.

Эта технология позволяет исследователям составлять подробные карты распространения сигналов в головном мозге. Направляя лазер на конкретные дендриты или группы клеток, ученые смогут точно определить, какие именно нейронные связи отвечают за сложные процессы обучения, формирования памяти и регуляции эмоционального фона. Отсутствие токсичности и возможность использовать глубоко проникающее инфракрасное излучение открывают путь к изучению этих процессов непосредственно в живом мозге, что важно для разработки новых методов лечения психических и неврологических заболеваний.

Источник:Angewandte Chemie International Edition