Мозг охладили до −196 °C, а затем полностью восстановили его функции: как ученые впервые перезапустили нервную ткань после глубокой заморозки

Крионика долгое время оставалась уделом научной фантастики и предметом торговли сомнительных стартапов. Проблема заключается в физических свойствах воды. При охлаждении ниже нуля градусов жидкости внутри и вокруг клеток начинают образовывать кристаллы льда. Эти кристаллы расширяются и механически разрывают клеточные мембраны, полностью уничтожая сложные нейронные связи — синапсы. В результате ткань необратимо теряет способность передавать электрические сигналы. Предыдущие попытки заморозить мозг приводили либо к разрушению структуры, либо к полной потере функций.

В исследовании, опубликованном в научном журнале PNAS, международный коллектив ученых представил метод, который позволил обойти это физическое ограничение. Исследователи смогли охладить ткани гиппокампа взрослой мыши — отдела мозга, отвечающего за память и пространственную ориентацию, — до температуры минус 196 градусов Цельсия, а после нагревания зафиксировать полное восстановление их электрофизиологической работоспособности.

Отказ от кристаллизации: метод витрификации

Чтобы предотвратить образование льда, ученые применили метод витрификации. Суть этого процесса заключается в том, что вода в биологических тканях замещается криопротекторами — специальными химическими веществами, которые препятствуют замерзанию. При очень быстром охлаждении такая смесь не кристаллизуется, а переходит в твердое аморфное состояние. Молекулы останавливают свое движение, и все биологические процессы в ткани полностью прекращаются без физического повреждения клеток.

Сложность метода заключается в высокой токсичности криопротекторов. Если их концентрация слишком мала, образуется лед. Если концентрация слишком велика или вещество находится в ткани слишком долго, клетки погибают от химического отравления и резкого изменения объема (осмотического стресса).

Ученые разработали строго контролируемый протокол для фрагментов (срезов) гиппокампа толщиной 350 микрометров. Они использовали раствор, состоящий из диметилсульфоксида, этиленгликоля и формамида. Ткань пропитывали этим составом поэтапно при температуре около 10 градусов Цельсия. Затем срезы помещали на медный цилиндр, охлажденный жидким азотом, обеспечивая скорость падения температуры на 130 градусов в секунду. Ткань достигала отметки минус 196 градусов, сохраняя полную прозрачность, что подтверждало отсутствие кристаллов льда. Нагревание происходило так же стремительно — со скоростью 80 градусов в секунду, после чего химические вещества постепенно вымывались из клеток специальными растворами.

Проверка клеточного дыхания и микроструктуры

Первым этапом оценки успешности эксперимента стала проверка физической целостности ткани. Электронная микроскопия показала, что клеточные мембраны, внутренние структуры нейронов и микроскопические отростки, с помощью которых клетки соединяются друг с другом, остались неповрежденными.

Далее ученым требовалось выяснить, возобновился ли метаболизм. С помощью специального оборудования они измерили уровень потребления кислорода тканями. Тесты показали, что митохондрии — структуры, обеспечивающие клетки энергией, — восстановили свою работу. Уровень базового клеточного дыхания у тканей, прошедших витрификацию при оптимальной концентрации раствора, практически не отличался от показателей контрольных, никогда не охлаждавшихся образцов мозга.

Восстановление электрической активности и механизмов памяти

Самая важная часть исследования касалась проверки работоспособности нейронных сетей. Нервная ткань выполняет свою функцию за счет генерации и передачи электрических импульсов. Исследователи подвели микроэлектроды к отдельным нейронам размороженных срезов и подали стимулирующий сигнал.

Клетки успешно сгенерировали потенциалы действия (электрические разряды). Ученые зафиксировали, что баланс между возбуждающими и тормозящими сигналами в нервной сети остался в пределах нормы. Это крайне важный показатель, так как любое нарушение этого баланса привело бы к неконтролируемой активности, сопоставимой с эпилептическим припадком, но нейроны работали стабильно. Разные типы клеток по-разному перенесли процедуру: пирамидальные нейроны стали чуть менее возбудимыми и требовали более сильного сигнала для реакции, тогда как гранулярные клетки сохранили свои свойства полностью неизменными.

Главным достижением стало сохранение способности ткани к долговременной потенциации. Это физиологический процесс, при котором нейроны усиливают связь между собой в ответ на повторяющуюся электрическую стимуляцию. В современной нейробиологии именно этот процесс считается базовым клеточным механизмом обучения и формирования памяти. Размороженная ткань реагировала на стимуляцию формированием новых, усиленных связей точно так же, как это делает мозг живого организма.

Масштабирование метода: эксперимент на целом мозге

Доказав работоспособность технологии на фрагментах ткани, ученые попытались витрифицировать целый мозг мыши, не извлекая его из черепа. На этом этапе они столкнулись с физиологией, защищающей нервную систему от попадания посторонних веществ из крови — гематоэнцефалическим барьером.

Стенки кровеносных сосудов в мозге покрыты клетками (астроцитами), мембраны которых содержат аквапорины — белковые каналы, свободно пропускающие воду, но блокирующие крупные молекулы. Когда ученые попытались ввести криопротектор через кровеносную систему, мозг начал стремительно отдавать воду, но не впитывал замещающий раствор. Орган потерял более половины своей массы из-за критического обезвоживания, что привело к гибели тканей.

Чтобы преодолеть эту проблему, был применен метод чередующегося уравновешивания. Исследователи вводили растворы через сосуды пульсирующими циклами, чередуя криопротектор с буферной жидкостью. Это позволило заместить воду химическими веществами более плавно. Мозг потерял в объеме лишь около 30 процентов, что оказалось допустимым пределом. После охлаждения целого органа до минус 140 градусов, последующего нагрева и вымывания химикатов, ученые извлекли фрагменты гиппокампа и снова подключили к ним электроды. Нейроны продемонстрировали способность передавать сигналы и образовывать усиленные синаптические связи.

Научное и практическое значение

Данное исследование не ставит целью развитие технологий заморозки человека. Но его результаты имеют огромное значение для лабораторной нейробиологии и смежных дисциплин.

Во-первых, технология позволяет решить проблему быстрой деградации извлеченной нервной ткани. Ученые смогут сохранять активные нейронные сети в твердом состоянии, хранить их длительное время и передавать в другие исследовательские центры. Это повысит воспроизводимость научных экспериментов и снизит потребность в использовании большого количества лабораторных животных.

Во-вторых, витрификация критически важна для коннектомики — направления науки, которое занимается созданием полной трехмерной карты всех синаптических связей в мозге. Замещение воды стеклующимся раствором фиксирует ткань в ее идеальном состоянии, предотвращая деформации, которые неизбежны при использовании стандартных химических фиксаторов.

С фундаментальной точки зрения результаты эксперимента доказывают, что функционирование нервной системы жестко привязано к ее физической структуре. Мозг способен пережить полную остановку всех молекулярных и метаболических процессов. Если пространственная конфигурация синапсов и целостность мембран сохранены физически, электрофизиологические процессы в ткани способны перезапуститься, возвращая нейронным сетям способность обрабатывать и сохранять информацию.

Источник:Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)